Quantificação absoluta de apolipoproteínas após tratamento com ácidos carboxílicos ômega-3 e fenofibrato usando um ensaio de SRM baseado em fragmentos de proteína recombinante marcado com isótopo estável de alta precisão

Peptídeos de padrão marcado com isótopo estável (SIS) são usados ​​como padrões internos em proteômica direcionada para fornecer quantificação de proteína robusta, que é necessária em ambientes clínicos. No entanto, os peptídeos SIS são tipicamente adicionados após a digestão com tripsina e, como a eficiência da digestão pode variar significativamente entre os peptídeos dentro de uma proteína, a exatidão e a precisão do ensaio podem ser comprometidas. Essas desvantagens podem ser corrigidas por uma nova classe de padrões internos introduzidos pelo projeto Human Protein Atlas, que são baseados em fragmentos de proteína recombinante SIS chamados SIS PrESTs. Os PrESTs SIS são adicionados inicialmente à amostra e os peptídeos SIS são liberados na digestão com tripsina. A tecnologia SIS perst é promissora para a quantificação absoluta de biomarcadores de proteína, mas não foi avaliada anteriormente em um ambiente clínico. Um fluxo de trabalho de extração em fase sólida automatizado e escalonável para dessalinização e enriquecimento de digestão de plasma foi estabelecido, permitindo a preparação simultânea de até 96 amostras. A quantificação robusta de alta precisão de 13 apolipoproteínas foi alcançada usando um novo ensaio LC-SRM / MS Tier 2 baseado em SIS multiplex em plasma humano não esgotado. O ensaio exibiu coeficientes de variação inter-dias entre 1,5% e 14,5% (mediana = 3,5%) e foi subsequentemente usado para investigar os efeitos dos ácidos carboxílicos ômega-3 (OM3-CA) e fenofibrato nessas 13 apolipoproteínas em amostras de plasma humano de um ensaio randomizado controlado por placebo, EFFECT I (NCT02354976) Nenhuma mudança significativa foi observada no braço OM3-CA, enquanto o tratamento com fenofibrato aumentou significativamente a apoAII e reduziu os níveis de apoB, apoCI, apoE e apoCIV. A redução da apoCIV após o tratamento com fenofibrato é um novo achado. O estudo demonstra que os PrESTs do SIS podem facilitar a geração de ensaios robustos de biomarcadores multiplexados Tier 2 para quantificação absoluta de proteínas em estudos clínicos.