Purificação e caracterização da nova protease olítica de fibrina (ogen) de Curcuma aromatica Salisb .: Papel na hemostasia

Fundo: As proteases de espécies de açafrão têm atividade pró-coagulante e fibrinogenolítica. Isso fornece uma base científica para o uso tradicional de açafrão para parar o sangramento e promover processos de cicatrização de feridas.

Propósito: Nossos estudos anteriores revelaram que a ação fibrinogenolítica da fração enzimática bruta de Curcuma aromatica Salisb., Foi considerada mais influente do que a de Curcuma longa L., Curcuma caesia Roxb., Curcuma amada Roxb. e Curcuma zedoria (Christm.) Roscoe. Portanto, o objetivo deste estudo é purificar e caracterizar a protease de C. aromatica e explorar seu papel no processo de cicatrização de feridas.

Métodos: A protease foi purificada por cromatografia de permeação em gel Sephadex G-50. O pico com atividade proteolítica potente foi submetido a recromatografia e depois verificado quanto à homogeneidade por SDS-PAGE e PAGE nativa. Além disso, a pureza do pico foi avaliada por RP-HPLC e MALDI-TOF. Foram realizadas as propriedades bioquímicas, tipo de protease, estudos cinéticos, atividades fibrinogenolítica, coagulante e fibrinolítica.

Resultados: Os dois picos proteolíticos foram fracionados em cromatografia de permeação em gel. Dentre estes, o pico-II apresentou potente atividade proteolítica com atividade específica de 10un / mg / min e denominado C. aromatica protease-II (CAP-II). Esta proteína foi resolvida em uma única banda nítida em SDS-PAGE (redutor e não redutor), bem como em PAGE nativo (ácido). É uma proteína monomérica, apresentando pico agudo em RP-HPLC e sua massa molecular relativa foi de 12,378 kDa. A atividade caseinolítica e fibrinolítica do CAP-II foi completamente inibida pelo fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF). O CAP-II exibiu temperatura ótima de 45 ° C e pH ótimo de 7,5. O Km e Vmax do CAP-II foram de 1,616µg e 1,62unidades / mg / min, respectivamente. O CAP-II mostrou hidrólise de todas as três subunidades de fibrinogênio na ordem Aα> Bß> γ. O CAP-II exibiu forte atividade pró-coagulante, reduzindo o tempo de coagulação do plasma humano. Também mostrou atividade fibrinolítica por hidrólise completa do α-polímero e do dímero γ-γ presentes na fibrina.

Conclusão: O CAP-II é uma nova serina protease de C. aromatica, que demonstrou interromper o sangramento e iniciar a cicatrização de feridas por meio de suas atividades pró-coagulante e da fibrina (ogen) olítica. Nosso estudo demonstra o possível papel do CAP-II, como enzima terapêutica para estancar o sangramento no momento do ferimento.