Estabelecimento de sistema de monitoramento em tempo real de TSH β no fotoperiodismo de mamíferos

Monitoramento em tempo real do TSHExpressão de β por bioluminescência. (A) Esquema experimental. PTs neonatais foram coletados no pós-natal 6–8 (P6–8) sob condições L12: D12, e camundongos de 5 a 6 semanas de idade foram coletados após serem mantidos em condições de dias curtos (SD) ou longos (LD) por 2-3 semanas. (B e D) Registro de bioluminescência em tempo real em fatias PT adultas ou neonatais dos genótipos indicados. As barras brancas e pretas nos gráficos indicam o dia subjetivo e a noite nos dias seguintes após a amostragem, respectivamente [n = 2, wild-type (WT) mice or n = 6, heterozygous TSHβ^Luc mice (+/L) in B; n = 5, WT and n = 17, +/L in D, average ± SEM]. (C e E) Monitoramento em tempo real das atividades do repórter da luciferase (luc) em fatias de PT adulto ou neonatal após a adição de veículo (Veh) ou melatonina (Mel). As fatias PT foram preparadas a partir de animais mantidos em condições LD (adulto, C) ou L12: D12 (recém-nascido, E). Veículo ou melatonina foi aplicado no início da cultura. As atividades normalizadas do repórter luc de fatias PT de camundongos + / L são mostradas (n = 4 em C e n = 3-4 em E, média ± SEM). (F) Confirmação das mudanças de nível de expressão em TSHβ, Eya3 e Cga no PT cultivado por análise qPCR. Fatias de PT neonatais foram tratadas com veículo ou 10 nm melatonina 48 h com monitoramento PMT. Níveis de expressão de TSHβ, Eya3 e Cga foram normalizados pelo valor de Six5, que foi expressado especificamente no PT. *P <0,05; **P <0,01 (duas amostras t-teste, n = 9, média ± SEM). Correlação entre TSHNíveis de β mRNA e contagens de bioluminescência (direita). Círculos brancos (Veh) e círculos cinza (Mel) indicam pontos de dados. A linha é regressão: r² = 0,71. (G) Quantificação das quantidades secretadas de TSHβ no meio de cultura das fatias de PT em 3F e S2 por análise de espectrometria de massa. **P <0,01 (duas amostras t-teste, n = 9, média ± SEM). Correlação entre as quantidades secretadas de TSHβ (meio) e TSHNíveis de β mRNA ou contagens de bioluminescência (direita). Círculos brancos (Veh) e círculos cinza (Mel) indicam pontos de dados. A linha é regressão: r² = 0,81 (meio), r² = 0,66 (direita).