O isolamento, purificação e caracterização dos principais metabólitos urinários da melatonina

A melatonina é metabolizada por hidroxilação para formar 6-hidroximelatonina e por desmetilação para formar N-acetil-serotonina, que são excretados como sulfato e conjugados de glucuronido. Precisamos desses metabólitos como pós puros e, portanto, empreendemos seu isolamento e caracterização. Três voluntários ingeriram 1 g de melatonina cada, e sua urina foi coletada e agrupada. Para os conjugados de sulfato, uma coluna de Lichoprep foi usada para concentrar os metabólitos e remover a maior parte da uréia. Os conjugados de sulfato foram separados dos glucuronídeos em uma coluna Florisil e posteriormente purificados em uma coluna de fractogel. Eles foram separados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), resultando em pós brancos de sulfato de 6-hidroxi-melatonina (SaMT) e sulfato de N-acetil-serotonina (SNAS). Para os conjugados de glucuronídeo, uma alíquota da urina reunida foi retirada à secura, o resíduo foi dissolvido em metanol e a solução foi filtrada. O filtrado de metanol foi levado à secura e o resíduo foi aplicado a uma coluna Florisil. Os conjugados de glucuronídeo isolados foram recristalizados antes da separação por HPLC, que deu pós brancos puros de N-acetil-serotonina glucuronídeo (GNAS) e 6-hidroxi-melatonina glucuronídeo (GaMT). A caracterização foi obtida usando espectroscopia de infravermelho e ultravioleta, cromatografia de camada fina (TLC) e cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GCMS). Estas técnicas confirmaram inequivocamente as estruturas atribuídas para SaMT e SNAS e apoiaram totalmente as estruturas atribuídas para GNAS e GaMT. Foram usados ​​três sistemas de solvente de TLC e, em cada caso, o metabólito conjugado individual apareceu como um ponto discreto. A pureza, conforme avaliada pelo GCMS, mostrou ser maior que 95% para SNAS, SaMT e GaMT e 88% para GNAS.