Um radioimunoensaio em miniatura para melatonina para uso com pequenas amostras de invertebrados

A melatonina foi identificada em vários invertebrados, mas pouco se sabe sobre suas funções ou seu controle circadiano. Os estudos nesta área são dificultados pela falta de um ensaio para melatonina que seja apropriado para uso com os pequenos volumes de amostra obtidos da maioria dos invertebrados e com o grande número de amostras sequenciais geradas por estudos circadianos. Descrevemos e validamos um novo protocolo de radioimunoensaio em miniatura (RIA) para esses fins. Volumes de amostra de c.50 microl foram extraídos com metanol e os extratos secos em tubos de vidro de 6 x 50 mm. Todo o ensaio foi conduzido nesses tubos. O volume de incubação foi de 200 microl. O ligando ligado foi precipitado e lavado nestes tubos, então 400 microl de fluido de cintilação foram adicionados e os tubos foram montados dentro de frascos de cintilação convencionais para contagem. As perdas de material devido à transferência entre contêineres foram eliminadas. RIAs anteriores para melatonina empregavam transferências múltiplas entre recipientes e seu uso com pequenos volumes de amostra pode resultar na perda de proporções substanciais da amostra. Duzentas amostras podem ser processadas juntas. A sensibilidade do ensaio foi de 2 pg de melatonina e a recuperação dos padrões internos foi de cerca de 100%. Dois anti-soros disponíveis comercialmente deram resultados muito semelhantes. O ensaio foi utilizado para quantificar os títulos de melatonina na hemolinfa do inseto Rhodnius prolixus (Hemiptera); a hemolinfa da escotofase continha 270 pg / ml de melatonina, em comparação com valores mínimos (c.40 pg / ml) durante a fotofase, revelando um ritmo diário. Este ensaio abre a porta para análises das funções e regulação circadiana da melatonina em invertebrados.