FIGURA 8.
Efeito do SMILE knockdown em …
FIGURA 8.
Efeito do knockdown de SMILE na regulação da hepcidina mediada por CREBH. UMA , hepcidina-Luc de camundongo …
FIGURA 8.
Efeito do knockdown de SMILE na regulação da hepcidina mediada por CREBH. UMA, hepcidina-Luc de camundongo foi co-transfectada apenas com pSuper ou pSuper siSMILE em células HepG2. Após 24 h, as células foram privadas de soro por 24 h seguido por tratamento com tunicamicina (5 μg / ml) por 12 h seguido por curcumina (Cur) tratamento (10 μm) por 12 h. Os experimentos foram realizados em triplicata e os dados são expressos em RLU e como a ativação do dobro em relação ao controle, representando a média ± DP de três experimentos individuais. *, p <0,05 e **, p <0,05 e #, p <0,05 em comparação com o controle não tratado, células tratadas com tunicamicina e tunicamicina mais curcumina mais células tratadas com pSuper, respectivamente. B, um ensaio ChIP é mostrado. As células HepG2 foram infectadas com Ad-shSMILE (moi 50) por 48 h e, em seguida, privadas de soro por 24 h, seguido por tunicamicina (5 μg / ml) e tratamento com curcumina (10 μm) por 12 h conforme indicado. A cromatina solúvel foi preparada e imunoprecipitada com anticorpo monoclonal contra PGC1α, CREBH ou IgG apenas como indicado. 10% da cromatina solúvel foi usada como entrada. PCR quantitativo em tempo real foi realizado para determinar e quantificar a ligação de PGC1α e CREBH ao promotor endógeno de hepcidina e foi normalizado para expressão de β-actina. Os dados representam a média ± DP de três experiências individuais. *, p <0,05 e **, p <0,05 e #, p <0,05 em comparação com o controle não tratado, tunicamicina (5 μg / ml) e tunicamicina (5 μg / ml) mais curcumina (10 μmcélulas tratadas), respectivamente. C, As células HepG2 foram infectadas com Ad-inespecífico siSMILE (Ad-USi) (50 moi) ou Ad-ShSMILE (50 moi) por 48 h seguido por tunicamicina (5 μg / ml) e curcumina (10 μm) tratamento. O RNA total foi isolado para análise semiquantitativa de RT-PCR da expressão de mRNA de hepcidina e foi normalizado para expressão de β-actina. Os dados representam a média ± DP de três experiências individuais. *, p <0,05 e **, p <0,05 e #, p <0,05 em comparação com o controle não tratado, tunicamicina (5 μg / ml) e tunicamicina mais curcumina (10 μm) mais células tratadas com Ad-USi, respectivamente. D, As células HepG2 foram infectadas com Ad-USiSMILE (50 moi) ou Ad-ShSMILE (50 moi) por 48 h seguido por tunicamicina (5 μg / ml) e curcumina (10 μm) tratamento. Western blot foi realizado para determinar o nível de proteína SMILE. E, a hepcidina-Luc foi co-transfectada com CREBH (300 ng) ou apenas pSuper (300 ng) ou pSuper siSMILE (300 ng) em células HepG2. Após 24 horas, as células foram privadas de soro por 24 horas, seguido por tratamento com curcumina (10 μm) por 12 h. Os experimentos foram realizados em triplicata e os dados são expressos em RLU e como a ativação do dobro em relação ao controle, representando a média ± DP de três experimentos individuais. *, p <0,05 e **, p <0,05 e #, p <0,05 em comparação com o controle não tratado, CREBH e CREBH mais curcumina mais células tratadas com pSuper, respectivamente. F, As células HepG2 foram infectadas com Ad-CREBH (50 moi) e Ad-USiSMILE (50 moi) ou Ad-ShSMILE (50 moi) por 48 h seguido por curcumina (10 μm) tratamento. O RNA total foi isolado para análise semiquantitativa de RT-PCR da expressão de mRNA de hepcidina e foi normalizado para expressão de β-actina. Os dados representam a média ± DP de três experiências individuais. *, p <0,05 e **, p <0,05 e #, p <0,05 em comparação com o controle não tratado, Ad-CREBH-N e Ad-CREBH + curcumina (10 μm) + Células tratadas com Ad-USi, respectivamente.
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