Detecção de N-nitrosomelatonina e outros derivados de N-nitrosotriptofano por transnitrosação de APF e DAF-2

Os S-nitrosotióis podem ser analisados ​​com alguns procedimentos de detecção simples e este fato acelerou fortemente a compreensão do impacto biológico dos S-nitrosotióis. Infelizmente, tais métodos analíticos simples estão ausentes atualmente para derivados de N-nitrosotriptofano de baixo peso molecular como N-nitrosomelatonina (NOMela). Aqui demonstramos que as aminas aromáticas primárias comercialmente disponíveis, ou seja, aminofenilfluoresceína (APF) e 4,5-diaminofluorescina (DAF-2), podem ser usadas para uma determinação quantitativa de NOMela. Em condições otimizadas (por exemplo, pH 11) dos ensaios, o tempo de vida dos derivados de N-nitrosotriptofano é amplamente prolongado e a reatividade dos S-nitrosotióis com aminas aromáticas pode ser ignorada com segurança. A influência de espécies reativas de óxido de nitrogênio como N2O3 é adicionalmente limitada no pH alcalino e pode ser ainda mais diminuída trabalhando em condições de hipóxia. Como resultado dessas condições ótimas, o ensaio APF tem um limite de detecção para NOMela de cerca de 25 nm, mas este ensaio falha em detectar resíduos de N-nitrosotriptofano ligados à proteína. O ensaio DAF-2, no entanto, pode ser usado para uma análise qualitativa de tais resíduos. Devido à alta eficácia do ensaio APF, é demonstrado com segurança que, em relação ao peroxinitrito, o N2O3 é cerca de 50 vezes mais eficaz na nitrosação da melatonina em pH fisiológico.


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